褐煤粉尘对矿区复垦土壤有机碳矿化及细菌群落的影响

王浩1,2，王伟1,2，薄慧娟1,2，张旭龙3，李泽瑾1,2，王海波1,2，张强1,2*，靳东升1,2* 1.山西农业大学资源环境学院 2.土壤环境与养分资源山西省重点实验室 3.中国农业大学资源与环境学院

摘要:煤粉尘沉降至地表后能够显著提高土壤有机碳含量，改变土壤理化性质和土壤微生物群落结构。通过添加褐煤粉尘的土壤培养试验，探究煤粉尘输入的有机碳对土壤有机碳矿化效果及细菌群落的影响。结果表明：在褐煤粉尘影响下，土壤CO2矿化量和矿化速率较对照组最大提升55.02%和54.58%（第5天）；土壤易氧化有机碳和土壤微生物生物量碳含量在培养结束后较最大值分别降低40.75和141.39 mg/kg。添加褐煤粉尘导致变形菌门的相对丰度显著降低，而酸杆菌、放线杆菌和厚壁菌门的相对丰度升高。褐煤粉尘输入的有机组分能够在短期内产生激发效应，其自身被土壤细菌分解的过程也能促进土壤CO2的矿化累积，并且提高土壤细菌群落的多样性和变异程度。褐煤粉尘中的有机碳极大程度参与了土壤有机碳库周转过程。关键词:褐煤粉尘 / 矿化过程 / 活性有机碳 / 官能团结构 / 土壤细菌群落 

煤粉尘是细小的煤炭颗粒，物质组成包括有机组分和无机组分，其所含有机组分随煤化程度的不同可以占到煤炭质量的20%~85%[1-3]。煤粉尘经扰动形成扬尘后再沉降至地表，能够显著提高该区域土壤总有机碳含量[4-5]，并且这部分有机碳能够在土壤中持续保留数十年[6-7]。国内外学者将土壤中来源于煤的这部分有机碳称为黑炭（black carbon，BC）[8-9]或地质成因有机碳（geogenic organic carbon，GOC）[10]。除提高土壤有机碳含量外，煤粉尘对土壤的其他理化性质也存在一定影响。聂小军等[11]发现煤粉尘在土壤内部的积累可以改善表层土壤的团粒结构性状。这是由于煤粉尘在团粒结构的形成中充当了有机胶结物质，这部分煤颗粒细小且伴生着伊利石等硅酸盐黏土矿物，因此使土壤团粒表现出比表面积大、亲水性强、表面负电性强等胶体特性[12]。煤粉尘颗粒具有疏松多孔的特点，能够提高土壤孔隙度并降低土壤容重，改善土壤空气流通和水分保持能力[13-14]。Spencer等[15]研究表明煤粉尘沉降的土壤表层全氮含量与煤粉尘量呈正相关关系，而刘平等[16]研究显示土壤表层全氮含量与降尘量和煤粉尘量之间并没有明显的相关性，二者结论上的差异可能与煤粉尘中氮含量及煤炭发育程度有关。

煤粉尘进入土壤后也会对土壤微生物产生诸多影响。Cohen等[17]制作了含有褐煤粉尘的固体培养基，在相同试验条件下培养多孔菌（Polyporus versicolor）和卧孔菌（Poria monticola），结果表明这2种真菌在生长过程中可以将固体褐煤粉尘降解为液体状态，并据此提出煤粉尘作为微生物生长基质的可能性。刘平等[16]通过分析煤粉尘沉降区域土壤，发现土壤中真菌和放线菌的数量随着煤粉尘量的增加而增加，细菌数量则无显著变化。Mukasa-Mugerwa等[18]提出土壤微生物对无烟煤的分解过程同时依靠了植物和根际真菌，二者合力将无烟煤中的有机组分转化成了腐殖酸的形式。也有研究表明煤粉尘对土壤微生物还存在着一些负面效应，如煤粉尘中广泛存在的重金属元素和多环芳烃对土壤部分微生物有显著的毒害作用[19]，这些重金属元素破坏微生物的细胞膜结构，甚至导致一些敏感种群的消失[20-21]。上述研究结论的差异也可能与煤粉尘及相应土壤的性质有较大关系。本研究基于课题团队对煤粉尘沉降的研究基础[7,16,22-23]，将中国北方煤矿复垦区的褐煤粉尘及土壤作为供试材料，开展土壤添加褐煤粉尘的培养试验，分析褐煤粉尘添加后土壤有机碳矿化率和活性有机碳组分的变化，探讨土壤细菌群落对褐煤粉尘的响应关系，以期为矿区煤粉尘利用及土壤保护与质量提升提供理论支撑。

1. 材料与方法                           

1.1材料与前处理

供试土壤取自山西省古交市屯兰矿区的煤矿复垦区长期定位平台，该区域年均降水量为460 mm，年均气温为9.5 ℃，土壤类型为黄绵土，土壤基本理化性质见表1。供试土壤在培养试验前经自然风干后过2 mm筛，并去除其中的根茎与石子等杂物。

褐煤材料取自内蒙古锡林郭勒胜利煤田，工业分析与元素分析如表2所示。为模拟自然状态的煤粉尘细颗粒，试验开始前将供试煤炭自然风干，打碎过2 mm筛后，使用行星式球磨机粉碎并过0.053 mm筛。

1.2土壤培养试验

土壤培养试验在25 ℃恒温条件下进行，分3个处理。褐煤粉尘添加量从低到高依次为5.62、14.26和22.89 g，HMA代表添加5.62 g褐煤粉尘的处理，HMB代表添加14.26 g褐煤粉尘的处理，HMC代表添加22.89 g褐煤粉尘的处理，设置3次重复。将不添加褐煤作为对照处理（CK）。土壤培养装置如图1所示，将混合均匀的供试土壤（200 g）和褐煤粉尘装入250 mL培养瓶，保持水分为田持的60%，平衡1周，每个培养瓶旁放置1 mol/L的NaOH溶液100 mL，用于收集培养期间的土壤CO2累积矿化量。

试验于2023年1月8日启动，在开始培养第5、15、30、50、75、120天进行破坏性取样，为减少检测CO2矿化量时可能出现的误差，破坏装置的同时立即测定土壤CO2累积矿化量。取样后将一部分土壤样品自然风干，另一部分土壤鲜样放在−80 ℃冰箱保存备用。为了避免不同时期取土而对土培产生人为的扰动，每个处理在6个取样时期均有各自专属的培养装置，将培养瓶从装置中取出后收集土壤样品，所剩的土壤不再继续参与培养过程。装置数量共计72个（3梯度×6时期×3重复+18个CK）。

1.3测定指标与方法

土壤CO₂矿化量的测定采用碱液吸收法。培养期间土壤释放的CO₂被装置中的1 mol/L NaOH溶液吸收后用碱液稀释至250 mL定容，取30 mL液体并加入10 mL的1 mol/L BaCl₂和2滴酚酞指示剂，再用0.5 mol/L的HCl溶液滴定并计算土壤CO₂矿化量。

土壤易氧化有机碳（readily oxidation carbon，ROC）的测定使用高锰酸钾氧化法。取含有15~30 mg碳的土壤样品（<0.25 mm），加入333 mmol/L的KMnO₄溶液25 mL，依次振荡、离心和稀释后在紫外分光光度计上于565 mm波长下比色。根据KMnO₄的消耗量可计算出土壤ROC含量。

土壤微生物生物量碳（microbial biomass carbon，MBC）的测定采用氯仿熏蒸法。取20 g新鲜土壤样品经氯仿熏蒸24 h后，加入80 mL 0.5 mol/L K2SO4浸提，再加入16.666 mmol/L K2Cr2O7溶液和浓硫酸，消煮后用0.05 mol/L的FeSO4溶液滴定，根据K2Cr2O7消耗量减去未熏蒸土壤的 K2Cr2O7消耗量计算土壤MBC含量。MBC的转换系数（Kec）为0.38。土壤有机碳官能团的红外光谱采用傅里叶红外光谱仪（Thermos Scientific Nicolet，美国）溴化钾压片法测定。称取土壤样品2 mg和纯KBr 200 mg，放入玛瑙研钵中充分研磨均匀，置于模具中压成透明薄片后放入红外光谱仪中测试，波长范围为400~4 000 cm−1，扫描次数为32次，分辨率为4 cm−1，空气作为背景，扫描时自动扣除背景光谱。土壤细菌群落测定使用16S rDNA高通量测序技术。使用Qubit 4.0 DNA试剂盒从土壤中收集DNA样本并保存在−80 ℃冰箱。土壤细菌在V3~V4区域使用引物（341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）进行PCR扩增，扩增产物经纯化和定量后形成测序文库。测序采用Illumina Miseq PE300测序平台（Illumina，Inc.，CA，美国），由生工生物工程（上海）公司完成。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 27.0软件进行方差分析；运用Origin 2021软件绘制图表；使用Canoco 5.0软件进行RDA冗余分析；使用在线分子生态网络分析通道对土壤细菌进行可视化操作，结合基因文库GTDB绘制细菌相对丰度图像。

2.结果与分析

2.1褐煤粉尘添加的复垦土壤有机碳矿化特征 

整个培养周期内各处理土壤CO2矿化量与矿化速率如图2所示。土壤CO2矿化量在培养0~15 d内迅速升高，而后呈缓慢上升的趋势，培养120 d后土壤CO2矿化量为362.3~401.8 mg/kg。培养第120天时，HMA、HMB、HMC处理在培养末期的CO2矿化量分别比CK处理提高了4.41%、4.82%和7.47%，从高到低排序为HMC>HMB>HMA>CK。添加褐煤粉尘的3个处理的CO2矿化量在培养周期内与CK处理相比差异显著（P<0.05）；而3种煤粉尘处理之间只有培养初始时具有显著的差异，随着培养时间的延长，HMA、HMB与HMC之间差异逐渐减弱。所有处理土壤CO2矿化速率均表现为先升高后逐渐降低的趋势，培养第15天时土壤CO2矿化速率达到峰值，HMA、HMB、HMC和CK 4个处理分别达到24.97、25.03、25.51和21.37 mg/（kg·d）。培养周期内，3个褐煤粉尘处理与CK处理的土壤CO2矿化速率均存在显著差异，而煤粉尘处理之间只在培养第5天时互相表现出显著的差异。

2.2褐煤粉尘添加的复垦土壤活性有机碳含量变化 

培养周期内土壤ROC含量变化如图3（a）所示。添加褐煤粉尘能够直接提高土壤ROC含量，添加量越高ROC含量也越大，且随着培养时间的延长而逐渐降低。经过120 d培养后，HMA、HMB、HMC和CK处理的土壤ROC含量分别比培养第5天减少了14.06、22.27、35.08和6.57 mg/kg，较培养初始时分别降低85.3%、78.9%、77.6%和84.8%。在整个培养过程中，3个煤粉尘处理之间以及与CK处理间始终存在着显著差异。培养周期内土壤MBC含量变化如图3（b）所示。整个培养过程中土壤MBC含量随培养时间延长呈现先升高后降低的趋势。在培养初期（0~15 d），褐煤粉尘能够在短期内使土壤MBC含量迅速提高，并且与CK处理之间形成显著差异。而在培养中期（30~50 d），3个煤粉尘处理的MBC含量均出现明显下降，直到第80天时下降至与CK处理水平基本一致，之后各处理间的差异也不再显著。

2.3褐煤粉尘添加的复垦土壤有机碳官能团结构组成变化 

3个梯度的褐煤粉尘处理具有相似的红外图谱（图4），但主要吸收峰的强度又存在着明显的差异，这表明褐煤粉尘改变了土壤有机碳官能团的种类和数量。3种煤粉尘处理在3 695和3 622 cm−1处的振动分别表示醇羟基和酚羟基的存在，前者富含没有形成氢键的自由羟基，后者比前者具有更稳定的氢键结构[24]。3 415 cm−1处的振动说明了氨基的存在，褐煤粉尘的氨基大部分来源于煤炭形成过程中，古植物体内的蛋白质残留物在经过部分热解和碳化后保留稳定的有机氮化合物。位于1 637和1 618 cm−1的双峰则是芳香族化合物典型的红外光谱特征[25]，标志着芳香族中C=C键的振动。在1 031 cm−1处发生的振动也来自于羟基，结合上述苯环的存在，褐煤粉尘带来的醇类化合物更有可能是化学性质稳定的苯酚。912 cm−1处主要是非氢和含氢单键的振动，包括C—O、C—N和C—H，534 cm−1处的吸收峰也表明了苯环的振动[26]。从图4可以看出，褐煤粉尘输入的有机碳中大部分是性质稳定的芳香族化合物，连接在苯环周围的官能团则以单键居多，长链的脂肪族化合物数量有限[24]。

2.4褐煤粉尘添加的复垦土壤细菌群落结构变化 

2.4.1 土壤细菌群落α多样性指数 通过对培养120 d后的土壤进行高通量测序，得到不同处理细菌群落的α多样性指数，结果如表3所示。与CK处理相比，褐煤粉尘进入土壤后均显著提高了土壤细菌群落分布的丰度和多样性；在3组褐煤粉尘处理中，HMB的细菌群落丰度提升最大，HMC的细菌群落多样性变异最大。褐煤粉尘添加量的提升，一定程度上能对土壤细菌群落产生正向的效果。

2.4.2土壤细菌群落结构组成分析 通过使用统计学分析大于1%门水平的细菌，观测各处理细菌的群落结构组成（图5）。细菌在门水平上主要包括变形菌（Proteobacteria）、酸杆菌（Acidobacteriota）、放线杆菌（Actinobacteriota）、拟杆菌（Bacteroidota）、金针菌（Gemmatimonadota）、浮游菌（Planctomycetota）、绿霉菌（Chloroflexi）、疣状菌（Verrucomicrobiota）、泉古菌（Cernarchaeota）等菌门，上述几种菌门占土壤中细菌总数的80%以上。

变形菌门是所有处理中最优势的细菌，在CK、HMA、HMB和HMC处理中相对丰度分别为52.6%、38.5%、41.8%和38.2%。HMA和HMB处理排在第2位的是酸杆菌门，占比分别为14.5%和10.1%；HMC处理中排第2位的是放线杆菌门，占比为11.5%；CK处理中排第2位的是拟杆菌门，占比为13.1%。这一数据表明，褐煤粉尘进入土壤后降低了占主导优势的变形菌门，提高了放线杆菌和酸杆菌等细菌群落的相对丰度。

2.5土壤细菌群落与有机碳组分相关性分析

土壤中ROC和MBC 2种形态的活性有机碳、土壤有机碳（SOC）及其矿化量与土壤细菌群落的冗余分析如图6所示。土壤中有机碳组分与土壤CO₂矿化量呈现正相关关系。在对土壤有机碳矿化过程的影响中，土壤MBC较土壤ROC具有更强的影响能力。从土壤细菌群落结构（门水平）与环境因子的相关性来看，排名前10的优势菌门中，放线菌、酸杆菌、金针菌、绿霉菌、泉古菌、厚壁菌与土壤MBC、ROC和SOC含量之间呈现正相关关系；而变形菌、拟杆菌、疣状菌和浮游菌则与土壤有机碳组分呈现负相关关系。

3.讨论

3.1添加褐煤粉尘对土壤有机碳矿化过程的促进效果 

培养周期内的褐煤粉尘处理在土壤CO2矿化量和矿化速率的方面表现出了与CK处理相同的趋势，但其处理间的差异与褐煤粉尘添加量有关。褐煤粉尘添加量越高，土壤CO2矿化量和矿化速率也越高，这一现象与外源有机物料输入的有机碳能够促进土壤有机碳的CO2矿化过程相似[27-28]，即褐煤粉尘对土壤有机碳产生正向的激发效应，其进入土壤后显著提高土壤SOC分解矿化的能力，并且添加量越高对这一效果的促进也越强。除上述对土壤有机碳的激发效应外，煤粉尘本身也可能发生矿化进一步释放CO2，从而对土壤CO2矿化量产生影响[29]。煤粉尘参与矿化的过程可描述为：当褐煤粉尘进入土壤后，其输入的有机碳在微生物作用下被分解矿化后向环境中释放CO2气体。对这一过程的研究表明，褐煤粉尘能够被土壤真菌分泌的胞外酶分解，分解后的产物可以被细菌所利用[30-31]。因此，认为褐煤粉尘提高土壤CO2矿化效果由2个部分构成：一是通过激发效应促进了土壤原来有机碳的矿化分解；二是通过土壤微生物的活动分解了煤粉尘中有机组分，进而提高土壤CO2矿化量。

3.2添加褐煤粉尘对土壤活性有机碳检出量的影响 

结合图2与图3（a）得知，土壤ROC含量降低趋势与土壤CO2矿化累积量增长趋势并不能直接关联，土壤ROC的下降并不能表明其参与了土壤有机碳矿化过程。分析认为产生这一现象的原因可能由检测方式所致，本研究中测定土壤ROC的办法是经333 mmol/L的KMnO4溶液氧化后，使用紫外分光光度计测定。而有研究表明，KMnO4在煤化工领域中常用于煤炭脱硫作用，经其氧化后可以降低煤中芳香结构的数量并提高煤炭的甲烷产出率[32-33]。上述方法使用的是浓度为0.05~0.25 mol/L的KMnO4溶液，而本试验中所使用的333 mmol/L的KMnO4溶液浓度明显要超过这一范围，过高浓度的KMnO4提取短链脂肪族上的碳及其侧链上的基团，并且由于煤炭中存在的多核芳烃和杂芳族结构亦会遭到破坏而解构[34-35]。因此对受煤粉尘影响土壤的ROC含量测定还需要寻找更合适的检测方式。

褐煤粉尘在培养初期显著提高了土壤MBC含量，表明其中所含有机组分导致土壤有机碳发生了激发效应，但这部分促进有机碳矿化分解的过程并不能持续保持。研究表明，添加物料的C/N对土壤微生物活性影响存在明显区别，外源添加的有机材料C/N不同，对土壤中微生物生物量碳和土壤CO2矿化过程的影响程度也不一致[36-37]。土壤微生物生命活动的最适C/N为25∶1，高于这一数值时土壤微生物缺少生存必需的氮，而过低的C/N则缺乏其生存需要消耗的有机碳，因此高C/N的有机物料在土壤中的表现更加稳定[38]。由表2可知，褐煤粉尘的C/N达到了61.28∶1，远超微生物生存最适的C/N，所以褐煤粉尘对土壤有机碳矿化的促进效果只能短期内出现却无法长久保持。 3.3 添加褐煤粉尘对土壤细菌群落结构的调整作用 对土壤细菌进行高通量测序的结果表明，添加褐煤粉尘导致土壤细菌群落结构发生显著的改变。褐煤粉尘进入土壤后显著提高土壤细菌群落的丰度、多样性和变异程度（表3）；缩减了丰度较大的菌群占比，增加丰度较小的菌群占比（图5），而土壤细菌对褐煤粉尘有机碳的利用在图5中也能够显现，如厚壁菌门在HMA和HMB处理中的显著增加，源自其中的芽孢杆菌对褐煤具有一定的生物溶解能力[39-40]，其在土壤有机碳的转化和分解中起到重要作用，也是形成土壤腐殖质的关键细菌。

图6也反映出相似的结论，排名前10的土壤细菌中与土壤有机碳矿化和活性组分呈正相关关系的占到了5种（放线菌、酸杆菌、金针菌、绿霉菌和泉古菌），这5种细菌的增量正好弥补了排名靠前的变形菌和拟杆菌在土壤内的损失。研究表明，变形菌是土壤细菌中丰度最高的一个细菌门类，其在富含有机碳的土壤中相对丰度表现为有所降低[41]，但这一降低并没有压制变形菌的活性。而土壤中的有机碳能更显著地促进其他菌群的扩增，例如有机碳能够促进放线菌门中红球菌和酸杆菌门中节杆菌的增加[42-43]。因此可以认为，土壤细菌群落在褐煤粉尘的影响下表现出有迹可循的变化，这些变化过程也证实褐煤粉尘中有机碳对土壤细菌群落活性存在着一定的促进效果。

4.结论

（1）褐煤粉尘可以促进土壤有机碳的矿化分解过程，并且在土壤微生物影响下分解部分自身所含的有机碳组分；其向土壤中输入大量的芳香族化合物的同时提高土壤ROC、MBC 2种活性有机碳的含量，但上述效果会随着时间延长而逐渐降低。

（2）褐煤粉尘进入土壤后能够改变土壤细菌群落的丰度和多样性，其一方面整体扩大了土壤细菌群落，另一方面提高土壤中占有优势或具备分解褐煤功能菌群的比例。

（3）褐煤粉尘输入的有机碳组分能够参与到土壤有机碳库的周转活动中，但其过高的C/N超过土壤微生物的最适范围，因此上述过程并不能持续维持。

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引用本文: 王浩，王伟，薄慧娟，等.褐煤粉尘对矿区复垦土壤有机碳矿化及细菌群落的影响[J].环境工程技术学报，2024，14（5）：1436-1443 doi: 10.12153/j.issn.1674-991X.20240210 文章来源：环境工程技术学报